一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>

　　酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay 簡(jiǎn)稱ELISA)是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatic techniques)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù),ELISA過程包括抗原(抗體)吸附在固相載體上稱為包被，加待測(cè)抗體(抗原), 再加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體(抗原),生成抗原(抗體)--待測(cè)抗體(抗原)--酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物，再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計(jì)的光吸收計(jì)算抗體(抗原)的量。待測(cè)抗體(抗原)的定量與有色產(chǎn)生成正比。

　　二.實(shí)驗(yàn)原理

　　用于免疫酶技術(shù)的酶有很多，如過氧化物酶，堿性磷酸酯酶，β-D-半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰膽堿酯酶，6-磷酸葡萄糖脫氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根過氧化物酶，堿性磷酸酯酶等，其中尤以辣根過氧化物酶為多。由于酶摧化的是氧化還原反應(yīng)，在呈色后須立刻測(cè)定，否則空氣中的氧化作用使顏色加深，無法準(zhǔn)確地定量。

　　辣根過氧化物酶(HRP)是一種糖蛋白，每個(gè)分子含有一個(gè)氯化血紅素(protonhemin)區(qū)作輔基。酶的濃度和純度常以輔基的含量表示。氯化血紅素輔基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的濃度和純度計(jì)算式是(已知HRP的A(1cm 403nm 1%)=25，式中1%指HRP百分濃度為100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶濃度以 mg/ml 計(jì)算是HRP的A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP純度(RZ)=A403nm/A275nm純度RZ(Reinheit Zahl)值越大說明酶內(nèi)所含雜質(zhì)越少。高純度HRP的RZ值在3.0左右，最高可達(dá)3.4。用于ELISA檢測(cè)的HRP的RZ值要求在3.0以上。

　　ELISA的基本原理有三條：

　　(1)抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫學(xué)活性;

　　(2)抗原或抗體可通過共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性;

　　(3)酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的.量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗(yàn)結(jié)果。

　　ELISA法是免疫診斷中的一項(xiàng)新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測(cè)定，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果，認(rèn)為ELISA法具有靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)。不僅適用于臨床標(biāo)本的檢查，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本,因此，也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查。本法不僅可以用來測(cè)定抗體，而且也可用于測(cè)定體液中的循環(huán)抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，可概括四個(gè)方面：

　　1、免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位。

　　2、研究抗酶抗體的合成。

　　3、顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)。

　　4、定量檢測(cè)體液中抗原或抗體成份。

　　基本方法一 用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法:

　　1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡(jiǎn)稱洗滌，下同)。

　　2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽性對(duì)照孔)。

　　3. 加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時(shí)，洗滌。

　　4. 加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。

　　5. 終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。

　　6. 結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)O·D值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔O·D值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽性。

　　基本方法二 用于檢測(cè)未知抗體的間接法：

　　用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg/ml， 每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。 ↓

　　加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌。(同時(shí)做空白、陰性及陽性孔對(duì)照) ↓

　　于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,最后一遍用DDW洗滌。 ↓

　　其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。

　　(二) 酶與底物

　　酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原, 半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物。

　　免疫技術(shù)常用的酶及其底物

　　終止劑為2mol/L H2SO4

　　終止劑為2 mol/L檸檬酸， 不同的底物有不同的終止劑。

　　可催化下列反應(yīng)： HRP+H2O2→復(fù)合物 復(fù)合物+AH2→過氧化物酶+H2O+A AH2 ——為無色底物, 供氫體; A—— 為有色產(chǎn)物。

　　(三) ELISA常用的四種方法

　　1.直接法測(cè)定抗原 將抗原吸附在載體表面;

　　加酶標(biāo)抗體，形成抗原—抗體復(fù)合物; 加底物。底物的降解量=抗原量。

　　2.間接法測(cè)定抗體

　　將抗原吸附于固相載體表面; 加抗體, 形成抗原-抗體復(fù)合物; 加酶標(biāo)抗體;

　　加底物。 測(cè)定底物的降解量=抗體量。

　　3.雙抗體夾心法測(cè)定抗原

　　將抗原免疫第一種動(dòng)物獲得的抗體吸附于固相表面;加抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物;

　　加抗原免疫第二種動(dòng)物獲得的抗體，形成抗體抗原抗體復(fù)合物;加酶標(biāo)抗抗體(第二種動(dòng)物抗體的抗體); 加底物。底物的降解量=抗原量。

　　4. 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗原

　　將抗體吸附在固相載體表面;

　　(1) 加入酶標(biāo)抗原;

　　(2),(3)加入酶標(biāo)抗原和待測(cè)抗原;

　　加底物。對(duì)照孔與樣品孔底物降解量的差=未知抗原量。

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