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細(xì)菌分離鑒定

時(shí)間:2024-03-11 14:22:38 雪桃 鑒定材料 我要投稿
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細(xì)菌分離鑒定

  大多數(shù)細(xì)菌均可以通過人工方法培養(yǎng),只有將微生物培養(yǎng)出來才能對它進(jìn)行研究、鑒定和應(yīng)用。下面是小編幫大家整理的細(xì)菌分離鑒定,僅供參考,歡迎大家閱讀。

  目的要求:

  熟悉臨床標(biāo)本中常見的病原性細(xì)菌的分離鑒定方法。

  實(shí)驗(yàn)內(nèi)容:

  一、膿汁、咽拭子等標(biāo)本中病原性細(xì)菌的分離與鑒定

  ()標(biāo)本采集

  1.膿拭子:用無菌棉簽蘸取患處深部膿液或分泌物少許,置入無菌空試管內(nèi),送檢。

  2.痰拭子:用消毒容器收集病人痰液,用無菌棉簽挑取膿稠痰塊,置入無菌空試管內(nèi),送檢。

  3.咽拭子:囑病人把口張大,用壓舌板壓住舌根,用無菌棉簽迅速蘸取咽部分泌物,置入無菌空試管內(nèi),送檢。

  4.血標(biāo)本:疑為敗血癥患者,在嚴(yán)格無菌操作下,靜脈采血,床旁直接加入含50ml的肉湯瓶內(nèi),立即搖勻后送培養(yǎng)。

  5.腦脊液:對疑似流腦患者,作腰椎穿刺取腦脊液,立即行直接床旁接種(送檢過程中應(yīng)注意保溫)。

  6.尿道、陰道分泌物:對可疑淋病患者,男性可從尿道取材,取材時(shí)導(dǎo)尿管應(yīng)進(jìn)入尿道1cm~2cm,如為剛排尿,應(yīng)等待1h左右;女性則可以從宮頸口取分泌物,當(dāng)內(nèi)窺器插入宮頸口后應(yīng)稍等片刻,再旋轉(zhuǎn)取出,取材應(yīng)立即送檢,不可放置冰箱。

  ()分離鑒定程序

  待檢標(biāo)本可直接做涂片染色檢查鑒定,必要時(shí)可做分離培養(yǎng)、生化反應(yīng)及致病性鑒定。常見的致病性球菌檢查程序如下。

  直接涂片、革蘭染色、鏡檢(形態(tài)、排列、染色性)

  膿、痰、咽拭子

  分泌物、腦脊液 觀察菌落性狀、溶血性、色素

  血瓊脂平板→ 涂片、染色、鏡檢

  ↑ 挑取可疑菌落 生化反應(yīng)

  血液、穿刺液 →肉湯培養(yǎng)基 純分離 致病性測定

  ↓ 藥敏試驗(yàn)

  如培養(yǎng)液混濁時(shí)可涂片、染色、鏡檢

  ()常見臨床標(biāo)本的檢查方法

  1.膿拭子

  在膿汁中除了球菌外,也有桿菌存在,例如革蘭陽性的有炭疽桿菌、白喉?xiàng)U菌、結(jié)核桿菌、枯草桿菌等,革蘭陰性的有大腸桿菌、綠膿桿菌、變形桿菌等,此外尚可有真菌、放線菌、螺旋體等。

  材

  (1) 標(biāo)本:膿拭子

  (2) 培養(yǎng)基:血瓊脂平板

  (3) 兔血漿、白色濾紙片、無菌生理鹽水、載玻片

  方 膿汁 → 革蘭染色 → 鏡檢

  ↓ ↑

  血瓊脂平板 →觀察菌落形態(tài)及溶血情況

  ↓

  致病力試驗(yàn)

  (1)將膿拭子作革蘭染色,鏡檢(先作培養(yǎng)再涂片以免污染)。標(biāo)本放置4℃冰箱保存,待報(bào)告發(fā)出后再丟棄。

  (2)將膿汁涂布于血瓊脂平板上,再以滅菌接種環(huán)作劃線分離。置培養(yǎng)37℃培養(yǎng)18h~24h。

  (3)經(jīng)培養(yǎng)后據(jù)菌落特點(diǎn)及涂片檢查結(jié)果進(jìn)行初步識(shí)別,根據(jù)需要再作進(jìn)一步鑒定。若菌落較大、溶血透明、產(chǎn)生金黃色色素、涂片為革蘭陽性球菌并成堆排列時(shí)可能系葡萄球菌,應(yīng)確定其為何種葡萄球菌;必要時(shí)再作血漿凝固酶試驗(yàn)及甘露醇發(fā)酵試驗(yàn),確定其致病力。

  2.咽拭子

  咽喉中存在的細(xì)菌較多,可以有厭氧及需氧性鏈球菌、葡萄球菌、肺炎球菌、四聯(lián)球菌、腦膜炎球菌、卡他球菌、喉?xiàng)U菌、結(jié)核桿菌枯草桿菌、百日咳桿菌肺炎桿菌及綠膿桿菌等。此外也可有白色念珠菌奮森螺旋體等。本實(shí)驗(yàn)以咽拭子作為標(biāo)本,重點(diǎn)檢查病原性球菌。

  材

  (1)標(biāo)本:咽拭子。

  (2)培養(yǎng)基:血瓊脂平板。

  方

  咽拭子

  ↓

  血瓊脂平板

  ↓

  觀察菌落形態(tài)及溶血性

  ↓

  革蘭染色,鏡檢

  取標(biāo)本涂布于血瓊脂平板,再以滅菌接種環(huán)劃線分離,置37℃培養(yǎng)18h~24h培養(yǎng)。標(biāo)本放置4℃冰箱保存,待報(bào)告發(fā)出后再丟棄。

  可根據(jù)下述特點(diǎn)進(jìn)行鑒別:

  (1)在菌落周圍產(chǎn)生2mm~4mm寬、界線分明、完全透明的溶血環(huán)、涂片為革蘭陽性球菌并呈鏈狀排列,可能是乙型溶血性鏈球菌。

  (2)菌落細(xì)孝半透明、有草綠色溶血環(huán)、涂片為革蘭陽性球菌呈鏈狀排列,可能為甲型溶血性鏈球菌。需要進(jìn)一步與肺炎球菌區(qū)別時(shí),可做膽汁溶菌試驗(yàn)及菊糖發(fā)酵反應(yīng)。

  菌落細(xì)小半透明、不溶血、涂片為革蘭陽性鏈狀排列的球菌時(shí),為丙型鏈球菌。

  (4)菌落扁平邊緣隆起、中央稍凹、半透明、呈草綠色溶血、革蘭染色為陽性雙球菌、呈矛頭狀排列時(shí)為肺炎球菌,應(yīng)以膽汁溶菌及菊糖發(fā)酵反應(yīng)與甲型溶血性鏈球菌區(qū)分。

  (5)菌落中等大孝表面光滑、呈灰色、革蘭染色為陰性雙球菌,呈腎形排列時(shí),可能為腦膜炎球菌,需要進(jìn)一步作氧化酶試驗(yàn)及糖發(fā)酵試驗(yàn)(接種于含血清之葡、麥、蔗糖發(fā)酵管中)。

  二、糞便標(biāo)本中腸道桿菌的分離與鑒定

  ()標(biāo)本收集

  取患者的糞便或肛-門拭子。

  ()鑒定程序

  腸道桿菌為一大群革蘭陰性桿菌,從形態(tài)及染色性上無法鑒別為何種菌,只能依靠生化反應(yīng)和血清學(xué)反應(yīng)進(jìn)行鑒定。

  患者糞便(粘液、膿血)→腸道選擇、鑒別培養(yǎng)基(如ss、中國藍(lán)、伊紅美蘭)

  ↓

  挑取可疑菌落(據(jù)大孝顏色、透明度而定)

  ↓

  雙糖鐵及其他鑒別培養(yǎng)基

  ↓

  據(jù)結(jié)果分析鑒定

  ↓

  玻片凝集(做出特異性診斷)

  葡萄糖乳糖動(dòng)力H2S尿素

  ⊕⊕±--艾希菌屬非致病菌

  ⊕+---克雷伯菌屬

  ⊕±+++變形桿菌

  ⊕-++-乙型副傷寒致病菌

  ⊕-+±-甲型副傷寒

  +-++-傷寒桿菌

  +----痢疾桿菌

  拓展:細(xì)菌的接種與分離技術(shù)方法有哪些?

 。ㄒ唬┢桨鍎澗分離法

  在被檢標(biāo)本中,;祀s有多種細(xì)菌,平板劃線分離法可使這多種細(xì)菌在培養(yǎng)基表面分散生長,各自形成菌落,以便根據(jù)菌落的形態(tài)及特征,挑選單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。常用的平板劃線分離法有以下兩種:

  1.連續(xù)劃線分離法 此法主要用于雜菌不多的標(biāo)本。用接種環(huán)取標(biāo)本少許,于平板1/5處密集涂布,然后來回作曲線連續(xù)劃線接種,線與線間有一定距離,劃滿平板為止。

  2.分區(qū)劃線分離法 本法適用于雜菌量較多的標(biāo)本。先將標(biāo)本均勻涂布于平板表面邊緣一小區(qū)(第一區(qū))內(nèi),約占平板1/5面積,再在二、三、……區(qū)依次連續(xù)劃線。每劃完一個(gè)區(qū),均將接種環(huán)滅菌一次。每一區(qū)的劃線均接觸上一區(qū)的接種線2~3次,使菌量逐漸減少,以獲得單個(gè)菌落。

 。ǘ┬泵娼臃N法

  該法主要用于單個(gè)菌落的純培養(yǎng)、保存菌種或觀察細(xì)菌的某些特性。用滅菌的接種環(huán)取單個(gè)菌落或少許細(xì)菌,從培養(yǎng)基斜面底部向上劃一條直線,然后從底部向上作連續(xù)曲線劃線,一直劃到斜面頂端。

 。ㄈ┮后w接種法

  多用于一些液體生化試驗(yàn)管的接種。用滅菌接種環(huán)取菌少許,在試管內(nèi)壁與液面交接處的管壁上輕輕研磨,使細(xì)菌混合于培養(yǎng)液中。

  (四)穿刺接種法

  此法主要用于半固體培養(yǎng)基、明膠及雙糖管的接種。用接種針取細(xì)菌少許,從半固體培養(yǎng)基中央,平行于管壁垂直刺入,接近管底但不可接觸管底,然后接種針沿原路退出。

 。ㄎ澹﹥A注平板法

  測定牛乳、飲水和尿液等標(biāo)本細(xì)菌數(shù)時(shí)常用此方法。將標(biāo)本經(jīng)適當(dāng)稀釋后,取一定量加入已滅菌的平皿內(nèi),傾入已溶化并冷卻至45℃左右的定量培養(yǎng)基,混勻,待凝固后倒置、培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)基內(nèi)的菌落數(shù)和稀釋倍數(shù),即可計(jì)算出標(biāo)本的細(xì)菌數(shù)。

 。┩坎冀臃N法

  常用于紙片法藥物敏感性測定,也可用于被檢標(biāo)本中的細(xì)菌計(jì)數(shù)。加定量的被檢菌液于瓊脂平板表面,然后用滅菌的L型玻璃棒反復(fù)涂布幾次,使被檢物均勻分布在瓊脂表面,然后貼上藥敏紙片培養(yǎng),或直接培養(yǎng)觀察結(jié)果。

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