傳染性法氏囊病毒HZ2株VP5基因缺失株的構(gòu)建

通過PCR方法,刪除傳染性法氏囊病毒HZ2株ORF A1和 ORF A2非重疊區(qū)的33 bp (96～129 bp)的同時(shí),引入NheⅠ酶切位點(diǎn)(GcTaGc)作為分子標(biāo)記,構(gòu)建含有A節(jié)段突變體的真核表達(dá)載體pCI-Nhe3,與HZ2株B節(jié)段真核表達(dá)載體pCI-mB在脂質(zhì)體介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維(CEF)細(xì)胞.用轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)液上清不斷地接種新鮮細(xì)胞,模擬病毒"傳代".結(jié)果表明,細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征發(fā)生變化,產(chǎn)生了類似野生IBDV感染細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE).電子顯微鏡觀察顯示,在細(xì)胞超薄切片中有IBDV病毒粒子.間接免疫熒光分析結(jié)果表明,拯救的ANhe3株病毒的結(jié)構(gòu)蛋白在CEF細(xì)胞得到了表達(dá),而非結(jié)構(gòu)蛋白(VP5)則不能表達(dá).針對(duì)A節(jié)段的RT-PCR,酶切鑒定及進(jìn)一步的序列測(cè)定結(jié)果驗(yàn)證了相應(yīng)核苷酸片段的缺失和分子標(biāo)記的引入.ANhe3株病毒接種不能導(dǎo)致11日齡SPF雞胚的死亡,相對(duì)HZ2株致死率(20%)明顯下降.本研究利用基于cDNA轉(zhuǎn)染和RNA聚合酶Ⅱ系統(tǒng)的IBDV反向遺傳系統(tǒng),構(gòu)建了IBDV VP5基因大片段缺失的毒株ANhe3株,為IBDV基因組學(xué)的研究提供了新方向,為進(jìn)一步探索病毒復(fù)制和致病機(jī)制以及開發(fā)基因缺失疫苗奠定基礎(chǔ).

作 者： 李龍 魏永偉 黃耀偉 于漣   作者單位： 李龍(浙江大學(xué)動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所,浙江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州,310029;浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系,杭州,310027)

魏永偉,于漣(浙江大學(xué)動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所,浙江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州,310029)

黃耀偉(College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, Blacksburg, 24061-0342, USA.) 

刊 名： 科學(xué)通報(bào)  ISTIC PKU 英文刊名： CHINESE SCIENCE BULLETIN  年，卷(期)： 2006 51(14)  分類號(hào)： Q93  關(guān)鍵詞： 傳染性法氏囊病毒   VP5   基因缺失   反向遺傳  

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