重組人PCNA突變體的克隆與穩(wěn)定表達(dá)

目的:構(gòu)建重組人PCNA突變體(mutant PCNA,mPCNA)的真核表達(dá)質(zhì)粒,并建立穩(wěn)定高表達(dá)該目的蛋白的宮頸癌細(xì)胞系Hela.為進(jìn)一步研究PCNA在DNA損傷修復(fù)中重要的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ).方法:將舍有定點(diǎn)突變的PCNA cDNA序列克隆到T載體中,然后再亞克隆到真核表達(dá)栽體pCDNA3.1/V5-His A上,構(gòu)建真核表達(dá)載體質(zhì)粒pCDNA3.1/V5-His A-mPCNA,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中;Western Blotting法檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況;白細(xì)胞記數(shù)法測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)速率.結(jié)果:真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1/V5-His A-mPCNA經(jīng)酶切、測(cè)序分析與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的序列完全一致;穩(wěn)定建系后,Western Blotting結(jié)果顯示在相應(yīng)位置可見(jiàn)清楚的目的條帶;穩(wěn)定高表達(dá)mPCNA的細(xì)胞系與野生型細(xì)胞相比兩者的生長(zhǎng)速率基本一致.結(jié)論:成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1/V5-His A-mPCNA;建立了穩(wěn)定高表達(dá)該突變體的Hela細(xì)胞系;PCNA突變體的高表達(dá)不影響Hela細(xì)胞的正常生長(zhǎng).

作 者： 位全芳 楊勁 曾益軍 周虎傳 李勁 劉洋 李杰 WEI Quan-fang YANG Jin ZENG Yi-jun ZHOU Hu-chuan LI Jin LIU Yang LI Jie   作者單位： 位全芳,楊勁,曾益軍,周虎傳,WEI Quan-fang,YANG Jin,ZENG Yi-jun,ZHOU Hu-chuan(第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部生化與分子生物學(xué)教研室,重慶,400038)

李勁,劉洋,李杰,LI Jin,LIU Yang,LI Jie(第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院全軍泌尿外科研究所,重慶,400038) 

刊 名： 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展  ISTIC 英文刊名： PROGRESS IN MODERN BIOMEDICINE  年，卷(期)： 2008 8(4)  分類(lèi)號(hào)： Q78 Q813  關(guān)鍵詞： 增殖細(xì)胞核抗原   突變體   穩(wěn)定轉(zhuǎn)染   Hela細(xì)胞  

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