“果膠酶在果汁生產(chǎn)中的作用”的實驗設計和實施
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2011年（第36卷）第12期
“果膠酶在果汁生產(chǎn)中的作用”的實驗設計和實施
陸
摘
要
奇沈紅梅蔣選榮
（江蘇省揚州市新華中學225009）
“果膠酶在果汁生產(chǎn)中的作用”本文介紹了在普通高級中學實驗室允許的條件下開展定量實驗的案例，并對課題的實驗果膠酶
生產(chǎn)應用
實驗設計
步驟及設計、實驗結果分析等具體問題進行討論。關鍵詞
“果膠酶在果汁生產(chǎn)中的作用”是人教版（選修）《生物技術實踐》“酶的研究與應用”一專題四中的課題一，課題要求學生能設計實驗探究溫度和pH對果此內容與學膠酶活性的影響以及果膠酶的最適用量，
“探究影響酶生的日常生活聯(lián)系緊密，并且又有必修一活性的條件”作基礎，因此對于學生來說并不困難，適教材要求有實驗方案的合進行實際動手操作。但是，
設計，還涉及到實驗變量的梯度設計，要想獲得理想的結果，必須進行反復多次的實驗和摸索。在實際教學學生對教材和參考資料中的實驗方案進行了過程中，
討論和實踐，并提出了改進措施，本文小結如下。11．1
實驗方案預實驗
確定水果的種類→確定制備果汁的方
1支加入1mL水作為空白對照，另加入10mL蘋果泥，
5支各加入1mL2%的果膠酶溶液，加酶的5支試管依5min、10min、15min、20min。處次在室溫下處理1min、
過濾15min，量取濾出的蘋果理完用沸水浴使酶失活，
汁的體積，確定果膠酶的作用時間。2．6
探究不同溫度對果膠酶活性的影響
設定溫度
20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，取7支梯度：10℃、
試管，編號后各加入10mL蘋果泥，另取7支試管，編號后各加入1mL2%的果膠酶溶液，先將蘋果泥和果膠20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃酶溶液分別在10℃、
水浴保溫10min，然后將相同溫度處理的蘋果泥和果膠酶溶液混勻后在相應的溫度下再保溫5min，處理完用沸水浴使酶失活，過濾15min，量取濾出的蘋果汁的確定不同溫度對果膠酶活性的影響。體積，2．7
探究不同pH對果膠酶活性的影響
設定pH梯
3、4、5、6、7、8、9，取8支試管，編號后各加入度：2、
10mL蘋果泥，另取8支試管，編號后各加入1mL2%的果膠酶溶液，用0．1mol/L的HCl溶液和質量分數(shù)為1%的NaOH溶液分別將蘋果泥和果膠酶溶液pH調節(jié)3、4、5、6、7、8、9等8個梯度，然后將相同pH的蘋成2、
果泥和果膠酶溶液混合，得到8種不同pH梯度的反應用蒸餾水將8支試管中溶液的體積調成一致（本體系，
實驗反應溶液總體積為16mL），室溫下保溫5min，處理完用沸水浴使酶失活，過濾15min，量取濾出的蘋果汁的體積，確定不同pH對果膠酶活性的影響。3
結果與分析
2%果膠酶用量對果汁濾出量的影響
設置2%
3．1
法→確定制備果汁的用量→確定果膠酶作用的檢測指標→確定果膠酶的用量→確定果膠酶的作用時間。1．222．1
探究實驗
①探究不同溫度對果膠酶活性的影
響；②探究不同pH對果膠酶活性的影響。
實驗材料與方法實驗材料
本實驗選用蘋果作為實驗材料，榨成
汁后使用；實驗中使用的果膠酶購自上海藍季生物技術有限公司，配成質量分數(shù)為2%溶液后使用。2．2
制備果汁的方法
選取一個中等大小的蘋果（約
200g）洗凈后，不去皮，切成小塊，放入榨汁機中，加入約200mL水，榨取2min，制得蘋果泥。量取一定體積的蘋果泥，不同條件下處理后，用濾紙進行過濾即可得到果汁。2．3
果膠酶活性的檢測指標
果膠酶能將果膠分解
成小分子物質，小分子物質可以通過濾紙，蘋果汁的體積大小體現(xiàn)了果膠酶催化分解果膠的能力。通過測定濾出的蘋果汁的體積大小作為果膠酶活性的檢測指標。2．4
確定果膠酶的最適用量
取5支試管，編號后各
0．5mL、1mL、2mL、4mL加入10mL蘋果泥，依次加入水、2%的果膠酶溶液，加水使每支試管反應體系的終體積室溫下作用足夠長時間，過濾15min，量取皆為14mL，
濾出的蘋果汁的體積，確定果膠酶的最適用量。2．5
確定果膠酶的作用時間
取6支試管，編號后各
果膠酶溶液體積梯度，分別催化相同體積的蘋果泥（10mL），催化后過濾，得到的蘋果汁的體積及澄清度如表1所示。
由表1可知，用不同量的果膠酶在室溫下處理10mL蘋果泥足夠長時間，在1～4號支試管中，隨著果膠酶量的增加，所得蘋果汁的體積隨之增加，但當2%的果膠酶溶液達到1mL后，繼續(xù)增加酶的量，所得蘋說明底物已經(jīng)耗盡，由此可果汁的體積幾乎不再增加，
推斷處理10mL蘋果泥的果膠酶溶液最適用量應為1mL左右。
2011年（第36卷）第12期
表1
試管編號2%的果膠酶溶液過濾后蘋果汁的體積過濾后蘋果汁的.澄清度
酶量對蘋果汁濾出量的影響105．4mL混濁
20．5mL8．5mL澄清
31mL9．3mL澄清
42mL9．5mL澄清
54mL9．5mL澄清
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3．2酶處理時間對果汁濾出量的影響
表2
試管編號果膠酶作用時間過濾后蘋果汁的體積過濾后蘋果汁的澄清度
取2%的果用不同的時間，得到的蘋果汁的體積及澄清度如表2所示。
35min7．8mL澄清
410min8．0mL澄清
515min8．0mL澄清
620min8．1mL澄清
分別作膠酶溶液1mL催化相同體積的蘋果泥（10mL），
104．5mL混濁
21min5．9mL澄清
酶的作用時間對蘋果汁濾出量的影響
由表2可知，在1～4支試管中，隨著果膠酶作用時間的增加，所得蘋果汁的體積隨之增加，但當酶作用時間增加到10min后，繼續(xù)增加酶的作用時間，所得蘋說明底物已經(jīng)耗盡，而當酶果汁的體積幾乎不再增加，
作用時間為5min（試管3）時，蘋果汁的體積幾乎到達
表3
試管編號
果膠酶的作用溫度
過濾后蘋果汁的體積（mL）過濾后蘋果汁的澄清度
110℃6．8澄清
220℃7．5澄清
所以1mL2%的果膠酶溶液完全處理10mL到最大值，
蘋果泥大概需要5～10min。3．3
果膠酶最適作用溫度
取1mL2%的果膠酶溶
在不同梯度的溫度液催化相同體積的蘋果泥（10mL），
下反應，得到的蘋果汁的體積及澄清度如表3示。
330℃8．0澄清
440℃7．0澄清
550℃5．5半混濁
660℃4．8混濁
770℃4．8混濁
溫度對酶活性的影響
由表3可知，在1～3試管中，隨著果膠酶作用溫蘋果汁的體積隨之增加，說明在10℃～度間的升高，
30℃溫度區(qū)間內，酶的活性隨著溫度的增加而升高，當酶作用溫度增加到30℃時，蘋果汁的體積達到最大說明此時果膠酶的活性最強。在3～6試管中如果值，
繼續(xù)升高溫度，蘋果汁的體積隨之減少，說明在30℃～60℃溫度區(qū)間內酶的活性隨溫度的升高而降低。當
表4
試管編號果膠酶的作用pH
蘋果汁的體積（mL）蘋果汁的澄清度
1210澄清
2310．5澄清
繼續(xù)升高溫度，蘋果汁的濾出量不再溫度達到60℃，
說明此時酶已經(jīng)完全失活。因此，最佳作用溫度改變，為30℃。3．4
最適pH
取1mL2%的果膠酶溶液催化相同體
在不同梯度的pH值下反應，得到積的蘋果泥（10mL），
的蘋果汁的體積及澄清度如表4所示。
pH對酶活性的影響3410．5澄清
4510．5澄清
568半混濁
675．8混濁
785．7混濁
895．8混濁
由表4可知，在1～4試管中，濾出的蘋果汁的體說明在pH在2～5時果膠酶都有較大活性，積都較大，
果膠酶適宜的pH范圍較廣泛。其中2～4試管中濾得的蘋果汁的體積最大，說明果膠酶的最適pH約在3～5之間。在4～6試管中，隨著pH的增加，蘋果汁的體積隨之減少，說明pH在5～7時，酶的活性隨著pH的pH達到7時，增大而升高，繼續(xù)升高pH，蘋果汁的濾出量不再改變，說明此時酶已經(jīng)失活。4
討論
果膠酶的最適溫度和最適pH值都較廣泛，究其果膠酶不是單一的一種酶，它是分解果膠的一類原因，
包括半乳糖醛酸酶、果膠分解酶、果膠酯酶酶的總稱，
等，因此果膠酶的最適溫度和最適pH是多種酶綜合溫度在10℃～40℃的適宜溫度和適宜pH。具體地說，
時其活性都較強（表3），在實際生產(chǎn)中，這樣的特性可以使果膠酶適應幾乎所有的季節(jié)。果膠酶的最適pH約在3～5之間，大多數(shù)的水果榨汁液都偏酸性，如蘋果泥pH在4左右，恰好在其最適pH范圍內，果膠酶因有這樣寬泛的作用條件，用于實際生產(chǎn)時，可以大大節(jié)約生產(chǎn)成本。
本實驗的實驗步驟較多，由多個小實驗構成，每個小實驗需要考慮的變量都不一樣，比較容易忽略的無關變量有：①蘋果泥的批次及黏稠度；本實驗的大部分因此所有的實驗都步驟及實驗數(shù)據(jù)有邏輯上的關聯(lián)，
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2011年（第36卷）第12期
小麥葉片光合色素提取方法比較
李
摘
要
菲任美燕耿慧欣呂艷偉
（山東省聊城大學生命科學學院252059）
以小麥為實驗材料，探究了2種提取方法（浸泡法和研磨法）和7種不同的提取液對光合色素提取效果的影響。結果表
明，研磨法操作復雜，但對葉綠素的提取效果較好，而且所用時間較短；浸泡法雖然操作簡便，但是葉綠素的損失較大，而且所用時80%丙酮與95%乙醇體積比為1：3時，光合色素提取量最高，為本實驗中最佳的間較長；mL在6種不同提取液的浸泡法比較中，光合色素提取方法。關鍵詞
小麥
浸泡法
研磨法
光合色素含量
目前一般采用分光光度計法測定植物光合色素絕對含量
［1］
少量的碳酸鈣和石英砂及5mL80%丙酮，將材料充分研磨，轉移至7號10mL具塞離心管中，定容至刻度，離
［3］
心10min（2000r/min），取上清液測定。
。葉綠素提取方法有多種，例如Arnon法
（也稱研磨法）、浸泡法。Arnon法是傳統(tǒng)的葉綠素測定方法，是將材料在80%丙酮溶液中研磨并經(jīng)過濾或測定提取液的光密度值來計算葉綠離心除去殘渣后，素含量。
此法產(chǎn)率較高，所需反應時間較短；浸泡法是將洗乙醇和水的混合液以凈的鮮葉直接進行浸提。丙酮、
及丙酮與乙醇混合液兩者均能夠進行提取葉綠素，這兩種提取法來進行測量葉綠素可行性比較大。張憲政證明了用等用不同配比的混合液對葉綠素進行提取，混合液提取葉綠素的可行性11．1
材料與方法試驗材料與儀器
培養(yǎng)皿、小麥種子、蒸餾水、濾
［2］
（2）浸泡法：將另外6份樣品分別置于1～6號離80%丙酮并分別向其中加入80%丙酮（1號）、心管中，
∶95%乙醇=3∶1（2號）、80%丙酮∶95%乙醇=2∶1（380%丙酮∶95%乙醇=1∶1（4號）、80%丙酮∶95%號）、
80%丙酮：95%乙醇=1∶3（6號）、乙醇=1∶2（5號）、
（此比例為體積比）10mL，定容至刻度，于暗處靜置72h浸取，取上清液測定（浸泡期間每3h震蕩1次）1．4
光合色素含量測定方法
［3］
。
分別以相應的提取液
。本文在前人研究的基646nm和663nm處的吸光值測定470nm、為對照，
A470、A646和A663，利用Lichtenthaler法計算光合色素含量。其中Chla（Chla=12．21A663－2．81A646）為Chlb（Chlb=20．13A646－5．03葉綠素a濃度（mg/L），
A663）為葉綠素b濃度（mg/L），Car（Car=（1000A470－3．27Chla－104Chlb）/229）為類胡蘿卜素濃度（mg/L）。根據(jù)提取液中光合色素濃度，換算成光合色素含量（mg/g）。1．5
數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
利用SPSS11．5軟件對試驗數(shù)據(jù)
進行單因素方差分析，若處理間差異顯著，則利用Tur-key’s進行處理間的多重比較。22．1
結果與分析
不同提取方法對葉綠素a含量的影響
從提取
礎上，就研磨法和浸泡法的差異進行了探究。
10mL移液管、紙、培養(yǎng)箱、剪刀、鑷子、電子天平、洗耳10mL具塞離心管、燒杯、滴管、研缽、分光光度計、球、
80%丙酮、95%乙醇。離心機、碳酸鈣、石英砂、1．2
幼苗培養(yǎng)及處理
選取大小一致、籽粒飽滿的小
置于培養(yǎng)皿中，室溫下用蒸餾水浸泡12h后麥種子，
25℃催芽。選取發(fā)芽一致的種子播于潔凈的底部鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，并向培養(yǎng)皿中加入適量的蒸餾共用6個培養(yǎng)皿。加蓋后，放水。每個培養(yǎng)皿40粒，
入25℃恒溫箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)期間添加適量蒸餾水以補充蒸發(fā)的水分，使培養(yǎng)液保持恒量。培養(yǎng)至小麥第二片幼葉完全展開時，將葉片剪下。1．3
葉綠素的提取
將剪下的葉片剪成碎片，并分別
稱取7份0．2g的樣品。取7個10mL具塞離心管分別編號為1～7號。用以下方法進行葉綠素的提�。�
（1）研磨法：將稱取的0．2g樣品置于研缽內，加入應該使用同一批次的蘋果泥，同時果膠泥是黏稠物，進行每組實驗時，都應該充分攪拌，減小實驗誤差；②同組對照實驗反應體積的一致性；加入不同酶量或調節(jié)pH梯度時都會影響反應體系的體積，而不同體積的反應體系會影響蘋果汁的濾出量，為控制無關變量，應用
含量上分析，其他6種提取方法均顯著高于80%的丙80%的丙酮浸泡法酮浸泡法，而且呈上升趨勢。其中，3∶1混合法、2∶1與其他6種提取方法相比差異顯著，
3∶1混合法、2∶1混混合法與1∶1混合法無顯著差異，
1∶3混合法、80%的丙酮研磨法具合法與1∶2混合法、有一定的差異（圖1）。
蒸餾水將每組對照實驗的總體積調至相同；③酶的作用時間；注意酶作用完要失活，否則過濾時，蘋果泥中酶還在起作用，不能精確設定酶的作用時間；④過濾的時間。過濾時間不同也會影響蘋果汁的濾出量，同組對照實驗中酶作用完后，應保證過濾時間相同。?
檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿
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