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固體組織蛋白提取
固體組織蛋白提取
1. 每100mg固體組織剪碎后加入0.5 ml裂解液，玻璃勻漿器上下手動(dòng)勻漿15次；或用高速機(jī)械勻漿器12,000 rpm 破碎組織。注意：初始組織的量應(yīng)在10-100mg范圍。肝腎組織蛋白含量高，提取時(shí)應(yīng)加較少量的組織，否則形成的蛋白膜厚、致密且難溶。
2. 取0.5ml組織勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管，加2倍體積的(1 ml)抽提試劑充分混勻。室溫或4℃靜置10分鐘，偶爾晃動(dòng)。注意：(1)組織量<10mg且靜置時(shí)間短30min，在下一步離心時(shí)所形成的蛋白膜易碎，此時(shí)可靜置30min。(2)提取脂肪組織時(shí)應(yīng)4℃靜置40min以上以充分去除油脂。
3. 10,000g 4℃離心10分鐘，溶液分為兩相，中間為蛋白膜。吸除上層液體；隨后用吸頭或針頭輕輕撥開(kāi)蛋白膜，吸除下層液體。蛋白膜將附著于離心管壁。注意：(1)離心速度過(guò)高將使蛋白膜過(guò)于堅(jiān)固，難以溶解。(2)如果初始組織量較少(<10mg)，離心后難以得到完整的蛋白膜，此時(shí)可吸去上下層液體，加入0.5-0.8ml純乙醇混勻，10,000g 4℃離心5分鐘。棄所有液體，蛋白沉淀在管底。
4. 敞開(kāi)管口，室溫10分鐘空氣干燥沉淀。
5. 每100mg組織所得到的蛋白加 200ml用戶(hù)自備的緩沖液，
95℃煮10分鐘。室溫放置20分鐘溶解沉淀。注意：(1)可4℃過(guò)夜溶解沉淀，偶有少量不溶性組織纖維碎片可離心去除。(2)有時(shí)染色體DNA可與蛋白質(zhì)一起被抽提出來(lái)，溶解時(shí)則形成粘稠物。延長(zhǎng)95℃熱變性時(shí)間、不時(shí)振蕩、用注射針頭反復(fù)抽吸，有助于徹底打斷DNA。
3．樣本組織RNA提�。喝∫旱４娴姆谓M織，研碎后加入RNAisoTMPlus，將 研碎的樣品完全覆蓋，室溫靜置至樣品完全融化，在研磨至裂解液呈透明狀。移至離 心管后加入l／5l塒AisoTMPlus體積量的氯仿，用力振蕩后移至離心管中，室溫靜置 5min。12，000rpm／min 4 0C離心15min，取出離心管吸取上清夜，移入新的離心管。向 上清中加等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10min。12，000rpm／min 4"C離心10min。 棄取上清，加入75％的乙醇lml，洗滌管壁后12，000 rpm／min4。C離心5min，棄去乙 醇。室溫干燥沉淀5min后加入適量RNase．free水溶解沉淀，完全溶解后置于--80℃ 保存。
4．按照試劑盒說(shuō)明在微管中配制反應(yīng)混合溶液，將提取的RNA),II入微管后70℃ 反應(yīng)5min，離心收集。依試劑盒說(shuō)明依次加入5×reaction buffer，Ribolock Ribonuclease inhibitor和10 mM Dntp mix，混勻后離心收集。置于25℃5min。加入逆轉(zhuǎn)錄酶，然 后置于25℃10min，再置于42℃60min，加熱到70℃10min停止反應(yīng)。
組織剪碎，稱(chēng)重，加裂解液（含蛋白酶抑制劑）后勻漿，超聲破碎也可以，注意要在冰上進(jìn)行。然后12000轉(zhuǎn)，10分鐘，4度，離心取上清，測(cè)蛋白濃度，加loading buffer煮沸5-10分鐘，做western
天根有一款樣本保存液，能迅速滲入組織細(xì)胞，高效抑制RNase活性
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