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植物中葉片蛋白的提取
植物中葉片蛋白質的提取
一、實驗目的
熟悉植物葉蛋白的幾種提取原理和方法，了解其意義及其應用價值。
二、實驗原理
植物葉蛋白或稱綠色蛋白濃縮物(leaf protein concentration，簡稱LPC)，是從新鮮植物葉片中提取的高質量濃縮蛋白質，不僅是畜禽生長發(fā)育和生產(chǎn)畜產(chǎn)品的主要營養(yǎng)物質，而且目前也正成為人類的保健營養(yǎng)理想食品之一。天然蛋白存在于為數(shù)甚多的植物體內(nèi)，對其分離應依據(jù)人們的利用目的及提取蛋白含量和品質加以考慮。
天然蛋白質一般在溶液中呈穩(wěn)定的親水膠體狀態(tài)，故LPC 亦稱葉蛋白膠。其特點是：
(1)水化作用 即蛋白質分子表面附有能有效防止蛋白質分子沉淀析出的水化膜；(2)電荷排斥作用 水化膜外還有電荷層(具陰、陽離子)能有效地防止蛋白質分子的凝集。故溶液蛋白質顆粒(溶質)呈溶解狀態(tài)；(3)欲提取植物組織中的蛋白質必須利用溶解度的差異進行分離純化(如鹽析、有機溶劑分級沉淀法、疏水層析、結晶、加熱、離心分離等法)，利用分子大小和形狀差異進行分離純化(分子篩層析法)；還可利用電荷性質的差異分離純化(離子交換法)。只要創(chuàng)造上述影響因素，即可使蛋白質從植物葉片中分離并沉淀出來。
植物葉蛋白提取一般遵循如下基本原則：盡可能提高樣品蛋白的溶解度，抽提最大量的總蛋白，減少蛋白質的損失；減少對蛋白質的人為修飾；破壞蛋白與其他生物大分子的相互作用，并使蛋白質處于完全變性狀態(tài)。根據(jù)該原則，植物葉蛋白制備過程中一般需要有四種試劑①離液劑：尿素和硫脲等；②表面活性劑：又稱去垢劑，早期常用NP-40、Tritonx-100等非離子型去垢劑，離子型去垢劑有SDS、膽酸鈉、LiDS 等，還有象CHAPS(含它的蛋白溶液可以凍存)與Zwittergent 等雙性離子去垢劑；
③還原劑：DTT、DTE、TBP、Tris-base 等；④蛋白酶抑制劑及核酸酶：EDTA、PMSF、蛋白酶抑制劑混合物(Protease inhibitor cocktails)等，如為了去除緩沖液中存在的痕量重金屬離子，可在其中加入0.1～5mmol/LEDTA，同時使金屬蛋白酶失活。
三、儀器和試劑
儀器
離心機、移液器、研缽、離心管、冰箱。
試劑
1. 20mL 樣品提取緩沖液：2.5mL 0.5mol/LTris-HCl
3. -20℃下預冷丙酮(含0.07%β-巰基乙醇)
4. -20℃預冷的80%丙酮(含0.07%β-巰基乙醇)
5. 飽和硫酸銨溶液 稱取(NH4)2SO4 80g，加蒸餾水100mL，加熱50～60℃，攪拌溶解，室溫過夜，用濃氨水調(diào)pH 至7.0
6. 0.05molpH7.0的磷酸緩沖液10％NaCl 0.1mol 醋酸95％乙醇
7. 植物葉片(草本植物、木本植物葉片等都可)
四、 實驗步驟
植物葉蛋白的提取主要有鹽析法、有機溶劑沉淀法、加熱法(含逐步和快速加熱)、 離心分離法、結晶和重結晶法等。依據(jù)今后的開發(fā)方向(以飼料為基礎，以食品、飲品為開發(fā)方向)及簡便易行和使用的原則，主要采用鹽析法、加熱法和有機溶劑法分離提取葉蛋白(冷提和熱提)。不同的提取方法，對樣品的處理方式、程度和要求不同，結果也有差異。
(一)(NH4)2SO4 沉淀法提取葉蛋白
取0.3g 植物葉蛋白，用液氮充分研磨轉入離心管中，加入3mL 提取緩沖液，搖勻并放在4℃條件下提取1h，充分溶解蛋白后，4℃10000r/min 離心20min，棄沉淀，上清液中加入(NH4)2SO4 ，混勻1h，按1：2(v/v)加入-20℃預冷的80%丙酮，混勻后4℃12000r/min 離心10min，沉淀在-20℃冰箱中放置20min，使丙酮完全揮發(fā)后加適量上樣緩沖液，待沉淀充分溶解后，4℃12000r/min 離心5min，取上清液即為所提取的葉蛋白溶液。
(二)改良丙酮沉淀法提取葉蛋白
取0.3g 左右的植物葉片，用液氮研磨，色素多的可按材料鮮重的10%加入PVP，并將充分研磨過的樣品轉入離心管中，加入4mL 的提取緩沖液，搖勻并放在4℃條件下提取1h，充分溶解蛋白。放置后的樣品充分搖勻，4℃10000r/min 離心30min，棄沉淀，上清液中加入
2.5～3倍體積的村-20℃條件下過夜，讓蛋白充分沉淀。之后，4℃10000r/min 離心30min，其上清，沉淀置于-20℃下，使丙酮完全揮發(fā)，如有必要加入上樣緩沖液溶解沉淀。緩沖液用量300ul，沉淀充分溶解后，轉移至1.5mL 離心管中，4℃12000r/min 離心15min ，取上清液即為所提取的葉蛋白溶液。
該方法提取的蛋白質，提取效率高，雜質干擾少，電泳結果蛋白條帶清晰，數(shù)量多。
(三)植物葉片總蛋白的提取—三氯醋酸—丙酮沉淀法
①在液氮中研磨適量的葉片；
②懸浮于含10%的三氯醋酸和含0.07%β-巰基乙醇(可用DTT 代替)的丙酮溶液在-20℃條件下冰�。�
③讓蛋白質沉淀過夜后離心(4℃ 10000r/min 離心30~60min)，棄上清；
④重懸沉淀浮于含0.07%β-巰基乙醇的預冷丙酮溶液中；
⑤離心(同上)后真空干燥沉淀；
⑥用上樣緩沖液溶解沉淀，離心；
⑦Brandford 法定量蛋白，然后分裝至Eppendof 管中保存在-78℃?zhèn)溆谩?/p>
(四)分步提取可溶性葉蛋白
(1)蛋白質浸出 ①水溶性蛋白質浸出：用0.05molpH7.0的磷酸緩沖液(或蒸餾水)將樣品制成勻漿液，然后離心15min(4000r/min)，收集上清液即蛋白質浸出液，再將沉淀物按上述操作重復兩次。②鹽溶性蛋白質浸出用10％NaCl 將前者剩余沉淀物分離提取兩次，收集蛋白質浸出液。
(2)蛋白質沉淀用0.1mol 醋酸將蛋白質浸出液pH 值調(diào)至蛋白質等電點(pH4.5左右)，即8體積蛋白質浸出液加入1體積0.1mol 醋酸，混勻，離心15min(3000r/min)，棄去上清液，沉淀物即為可溶性葉蛋白。
(3)蛋白質收集于沉淀物中加入95％乙醇，混勻，用定量濾紙過濾或抽濾，待風干后收集。
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