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蛋白提取實(shí)驗(yàn)步驟
蛋白提取實(shí)驗(yàn)步驟：
1、細(xì)胞總蛋白提取
A、對于懸浮細(xì)胞: 離心收集細(xì)胞，每106細(xì)胞加250 ul RIPA（在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑），振蕩。如果需要提高蛋白濃度，可以適當(dāng)減少細(xì)胞總蛋白提取試劑體積。
B、對于貼壁細(xì)胞:
a、用TBS沖洗細(xì)胞2-3次。最后一次http://www.oriental01.com徹底吸干殘留液。
b、加入適當(dāng)體積的 RIPA（使用前數(shù)分內(nèi)加入蛋白酶抑制劑）于培養(yǎng)板、瓶內(nèi)3-5分鐘。期間反復(fù)晃動培養(yǎng)板、瓶，使試劑與細(xì)胞充分接觸。
c、用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞及試劑刮下，收集到1.5ml離心管中。
C、冰浴30min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保細(xì)胞完全裂解。
D、12000g離心5min，收集上清，即為總蛋白溶液。
2、組織蛋白提�。�
A、組織塊用冷TBS洗滌2-3次，去除血污，剪成小塊置于勻漿器。加入10倍組織體積本試劑（使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑）冰上徹底勻漿。如果需要提高蛋白濃度，可以適量減少該試劑體積。
B、將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，振蕩。冰浴30min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保細(xì)胞完全裂解。
C、12000g離心5min，收集上清，即為總蛋白溶液。
注意事項(xiàng)
1、組織盡可能新鮮，若不能及時提蛋白，組織標(biāo)本應(yīng)保存在-80℃冰箱，并避免反復(fù)凍融。
2、全程必須在冰上進(jìn)行，避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制劑在水溶液中不穩(wěn)定，需在RIPA使用前數(shù)分鐘加入蛋白酶抑制劑。
4、裂解過程中如有溶液粘稠現(xiàn)象可用移液器（200μl）反復(fù)吹打，或再加入適量裂解液以保證充分裂解。
5、總蛋白溶液不穩(wěn)定（蛋白酶依舊有活性）可在-80℃短時間保存，建議立即加入蛋白上樣緩沖液變性后與-20℃保存，避免反復(fù)凍融。
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