蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的比較

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第３１卷第４期２００８年０４月Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．４Ａｐｒ．２００８第一文庫(kù)網(wǎng)

蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的比較

郭穎娜，孫

（華北制藥股份有限公司，河北

［摘

衛(wèi)

石家莊

０５００２７）

存在和進(jìn)化都密切相關(guān)，蛋白質(zhì)含量測(cè)定涉及到生產(chǎn)和科研的眾多領(lǐng)域。目前常用的方法有要］蛋白質(zhì)與生命的起源、

凱氏定氮法、雙縮脲法（Ｂｉｕｒｅｔ）、紫外吸收法、考馬斯亮藍(lán)法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）。本文總結(jié)各種方法的特點(diǎn)及適用條件，針對(duì)不同的待測(cè)樣品以及對(duì)測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性的要求不同，我們可以采用不同的方法來測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的含量。

［關(guān)鍵詞］蛋白質(zhì)；凱氏定氮法；雙縮脲法；紫外吸收法；考馬斯亮藍(lán)法［中圖分類號(hào)］ＴＳ２１２．７

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］Ａ

［文章編號(hào)］１００３－５０９５（２００８）０４－００３６－０２

蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法，是生物化學(xué)研究中最常

用、最基本的分析之一。目前常用的方法有凱氏定氮法、雙縮脲法（Ｂｉｕｒｅｔ）、紫外吸收法、考馬斯亮藍(lán)法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）。其中Ｂｒａｄｆｏｒｄ法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏１０～２０倍，比Ｂｉｕｒｅｔ法靈敏１００倍以上。凱氏定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。這４種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，在選擇方法時(shí)應(yīng)考慮：⑴實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和精確度；⑵蛋白質(zhì)的性質(zhì)；⑶溶液中存在的干擾物質(zhì)；⑷測(cè)定所要花費(fèi)的時(shí)間。

１凱氏定氮法１．１原理

凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)分為樣品消化、蒸餾、吸收和滴定４個(gè)過程。其原理是樣品中含氮有機(jī)化合物與濃硫酸在催化劑作用下共熱消化，含氮有機(jī)物分解產(chǎn)生氨，氨又與硫酸作用，變成硫酸銨。然后加堿蒸餾放出氨，氨用過量的硼酸溶液吸收，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定求出總氮量換算為蛋白質(zhì)含量。１．２特點(diǎn)

凱氏定氮法是目前分析有機(jī)化合物含氮量常用的方法，是測(cè)定試樣中總有機(jī)氮最準(zhǔn)確和最簡(jiǎn)單的方法之一，被國(guó)際國(guó)內(nèi)作為法定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。凱氏定氮法樣品的最佳消化條件為硫酸銅２．５０ｇ，硫酸鉀０．１０ｇ，濃硫酸４．００ｍＬ；硫酸銅的用量為影響消化時(shí)間的主要因素，硫酸鉀和濃硫酸用量為第二和第三主要因素；用此最佳條件做實(shí)驗(yàn)，消化時(shí)間僅為

［收稿日期］２００８－０２－１３

［作者簡(jiǎn)介］

郭穎娜（１９７９－），女，助理工程師，從事質(zhì)檢工作。

１２ｍｉｎ；與其他硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸用量方法對(duì)比，該法所需消化時(shí)間最短，試劑用量減少，可降低實(shí)驗(yàn)成本，也降低了對(duì)環(huán)境的污染。

凱氏定氮法適用范圍廣泛，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，但操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)，試劑消耗量大。若采用模塊式消化爐代替?zhèn)鹘y(tǒng)的消化裝置，可同時(shí)測(cè)定幾份樣品，節(jié)省時(shí)間，提高了工作效率，適用于批量蛋白質(zhì)的測(cè)定，具有準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、低耗、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。２雙縮脲法（Ｂｉｕｒｅｔ）２．１原理

雙縮脲（ＮＨ３ＣＯＮＨＣＯＮＨ３）是兩個(gè)分子脲經(jīng)１８０℃左右加熱，放出１個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與ＣｕＳＯ４形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能夠以１個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)，故可用來測(cè)定蛋白質(zhì)含量。２．２特點(diǎn)

雙縮脲法中樣品的取用量對(duì)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性有顯著影響，采用０．５ｇ樣品，４０ｍＬ雙縮脲試劑的比例具有較高的檢測(cè)精度。雙縮脲法對(duì)不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，不受溫度的影響�？煽焖贉y(cè)定蛋白質(zhì)含量，試劑單一，方法簡(jiǎn)便，但靈敏度差，測(cè)定范圍為１～２０ｍｇ蛋白質(zhì)。適用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定，常用于谷物蛋白質(zhì)含量測(cè)定。３紫外吸收法３．１原理

蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性

第４期郭穎娜孫衛(wèi)：蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的比較?３７?

質(zhì)，吸收峰在２８０ｎｍ處，其吸光度（即光密度值）與蛋

白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在２３８ｎｍ的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長(zhǎng)下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。３．２特點(diǎn)

最常用的紫外吸收法是２８０ｎｍ的光吸收法，含有核酸的蛋白質(zhì)溶液使用２８０和２６０ｎｍ的吸收差法較好。蛋白質(zhì)的稀溶液采用２１５與２２５ｎｍ的吸收差法。紫外吸收法簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測(cè)定，測(cè)定后仍能回收使用。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測(cè)，因?yàn)榇藭r(shí)只需測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對(duì)值。

缺點(diǎn)是測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)較多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)有一定的誤差，故該法適于用測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。核酸在紫外區(qū)也有強(qiáng)吸收，但通過校正可以消除。但是因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過校正，測(cè)定的結(jié)果還是存在一定的誤差。此外，進(jìn)行紫外吸收法測(cè)定時(shí)，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因ｐＨ的改變而有變化，因此要注意溶液的ｐＨ值，測(cè)定樣品時(shí)的ｐＨ要與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的ｐＨ相一致。４考馬斯亮藍(lán)法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）４．１原理

Ｂｒａｄｆｏｒｄ法是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。考馬斯亮藍(lán)是一種有機(jī)染料，在游離狀態(tài)下呈紅色，在稀酸溶液中與蛋白質(zhì)的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，其最大吸收波長(zhǎng)從４６５ｎｍ變?yōu)椋担梗担睿�，蛋白質(zhì)在１～１０００μｇ范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)－色素結(jié)合物在５９５ｎｍ波長(zhǎng)下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。

４．２特點(diǎn)

考馬斯亮藍(lán)Ｇ－２５０與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)十分迅速而穩(wěn)定，２ｍｉｎ左右即達(dá)到平衡，其結(jié)合物室溫下１ｈ內(nèi)保持穩(wěn)定，且在５～２０ｍｉｎ之間，顏色的穩(wěn)定性最好。該法方法簡(jiǎn)便，易于操作，所用試劑較少，顯色劑易于配制。干擾物質(zhì)少，如糖、緩沖液、還原劑和絡(luò)合劑等均不影響顯色。此法的缺點(diǎn)是由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Ｂｒａｄｆｏｒｄ法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用γ－球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Ｂｅｅｒ定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。該方法適用于要求靈敏度高、快速定量測(cè)定微量蛋白質(zhì)的測(cè)定。５結(jié)語(yǔ)

４種蛋白質(zhì)測(cè)定方法比較如表１所示。

表１

方法

靈敏度

蛋白質(zhì)測(cè)定方法的比較

時(shí)間

原理

說明

量的準(zhǔn)確測(cè)定；干

凱氏定靈敏度低，適用于氮法

０．２～１．０ｍｇ

費(fèi)時(shí)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為氮，用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含８～１０ｈ用酸吸收后滴定。擾少；費(fèi)時(shí)太長(zhǎng)。